共聚焦顯微鏡是一種利用點(diǎn)光源照射、點(diǎn)探測(cè)器接收，并通過共軛針孔消除離焦光干擾的高分辨率光學(xué)成像技術(shù)。它突破了傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡的分辨率限制，尤其擅長(zhǎng)三維成像、光學(xué)切片和活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)，是生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。
一、核心原理：共軛聚焦與光學(xué)切片
1.點(diǎn)照明： 激光光源發(fā)出的光束通過照明針孔，聚焦成非常小的點(diǎn)照射到樣本的特定焦平面上的一個(gè)點(diǎn)。
2.點(diǎn)探測(cè)： 樣本被激發(fā)產(chǎn)生的熒光(或反射光)信號(hào)，只有來自焦平面的信號(hào)才能精確地通過探測(cè)針孔到達(dá)探測(cè)器(通常是光電倍增管PMT或雪崩光電二極管APD)。
3.消除離焦光： 來自樣本非焦平面(上方或下方)的散射光或熒光信號(hào)，在通過探測(cè)針孔時(shí)會(huì)被阻擋，無法到達(dá)探測(cè)器。這就是共軛針孔(照明針孔和探測(cè)針孔共軛) 的核心作用。
4.掃描成像： 為了獲得整幅圖像，聚焦的激光點(diǎn)需要通過掃描振鏡系統(tǒng)在樣本的X-Y平面上進(jìn)行逐點(diǎn)掃描。探測(cè)器在每個(gè)掃描點(diǎn)同步記錄光強(qiáng)信號(hào)。
5.光學(xué)切片： 通過精確控制物鏡的Z軸位置(上下移動(dòng)樣本或物鏡)，可以在樣本的不同深度獲取一系列清晰的二維圖像(X-Y平面圖像)。這些圖像被稱為光學(xué)切片。
6.三維重建： 將采集到的一系列光學(xué)切片通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行疊加和處理，即可重建出樣本的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。
二、關(guān)鍵組件
1.激光光源： 提供高強(qiáng)度、單色性好、方向性好的激發(fā)光。通常配備多個(gè)不同波長(zhǎng)的激光器，用于激發(fā)不同的熒光染料。
2.掃描裝置：
掃描振鏡： 核心部件，通常是兩個(gè)高速振動(dòng)的反射鏡(X軸和Y軸)，精確控制激光束在樣本表面的掃描路徑。
掃描透鏡與管透鏡： 確保掃描光束精確聚焦在物鏡的后焦面，實(shí)現(xiàn)無畸變掃描。
3.分光鏡/二向色鏡： 將激發(fā)光反射到樣本方向，同時(shí)允許樣本發(fā)射的熒光透射到探測(cè)光路。需要根據(jù)所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜選擇合適的鏡片。
4.物鏡： 高質(zhì)量、高數(shù)值孔徑(NA)的物鏡至關(guān)重要，它決定了系統(tǒng)的分辨率、光收集效率和成像深度。
5.共軛針孔：
照明針孔： 位于光源后，將激光變成點(diǎn)光源。
探測(cè)針孔： 位于探測(cè)器前，阻擋離焦光。針孔大小可調(diào)，是控制光學(xué)切片厚度和圖像信噪比的關(guān)鍵參數(shù)(小針孔切片薄、分辨率高但信號(hào)弱；大針孔切片厚、信號(hào)強(qiáng)但分辨率降低)。
6.探測(cè)器： 通常是高靈敏度的光電倍增管或雪崩光電二極管，將微弱的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。
7.計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)： 控制掃描、Z軸移動(dòng)、激光強(qiáng)度、針孔大小、探測(cè)器增益、圖像采集和處理等所有參數(shù)。
8.熒光濾光片組： 位于探測(cè)光路中，進(jìn)一步阻擋殘留的激發(fā)光和其他波長(zhǎng)的雜散光，確保探測(cè)到的是特定發(fā)射波長(zhǎng)的純凈熒光信號(hào)(發(fā)射濾光片)。
三、主要優(yōu)勢(shì)
1.高軸向分辨率(Z分辨率)與光學(xué)切片能力： 這是突出的優(yōu)勢(shì)。能清晰區(qū)分樣本中不同深度的結(jié)構(gòu)，獲得樣本內(nèi)部不同層面的清晰圖像，無需物理切片即可進(jìn)行三維成像。
2.高對(duì)比度： 有效抑制離焦背景光干擾，顯著提高圖像的清晰度和信噪比，特別適合觀察厚樣本或弱熒光信號(hào)。
3.高分辨率： 相比傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的X-Y平面分辨率也有一定提升(約1.4倍)，尤其在利用某些技術(shù)后分辨率可接近光學(xué)衍射極限。
4.三維重建： 可對(duì)活體或固定樣本進(jìn)行非侵入性的三維結(jié)構(gòu)解析。
5.多通道成像： 可同時(shí)或依次使用不同波長(zhǎng)的激光激發(fā)不同的熒光標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記樣本的多通道成像，研究不同分子或結(jié)構(gòu)的共定位。
6.活細(xì)胞成像： 減少光毒性和光漂白(相對(duì)于寬場(chǎng)需要更短的曝光時(shí)間獲取清晰圖像)，結(jié)合合適的培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于長(zhǎng)時(shí)間觀察活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過程。
7.圖像后處理： 強(qiáng)大的軟件支持進(jìn)行三維可視化、表面渲染、體積測(cè)量、共定位分析、熒光強(qiáng)度定量分析等。
四、主要應(yīng)用領(lǐng)域
1.細(xì)胞生物學(xué)：
細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞骨架)。
細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與流動(dòng)性。
細(xì)胞內(nèi)離子濃度(如Ca²?, pH)成像。
基因表達(dá)與蛋白定位。
細(xì)胞間相互作用(如免疫突觸)。
細(xì)胞遷移與分裂。
2.神經(jīng)科學(xué)：
神經(jīng)元形態(tài)與樹突棘結(jié)構(gòu)。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接。
突觸結(jié)構(gòu)與功能。
神經(jīng)遞質(zhì)釋放與受體分布。
3.發(fā)育生物學(xué)： 胚胎發(fā)育過程的三維形態(tài)發(fā)生、基因表達(dá)模式。
4.病理學(xué)與臨床診斷：
組織病理學(xué)切片分析(提供比普通光鏡更豐富的亞細(xì)胞信息)。
皮膚科在體共聚焦顯微鏡用于無創(chuàng)診斷皮膚病(如黑色素瘤)。
5.免疫學(xué)： 免疫細(xì)胞激活、遷移、與靶細(xì)胞的相互作用。
6.微生物學(xué)： 細(xì)菌、真菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、生物膜結(jié)構(gòu)。
7.植物學(xué)： 植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁、葉綠體、基因表達(dá)。
8.材料科學(xué)： 材料表面形貌、涂層厚度、薄膜結(jié)構(gòu)、微電子器件檢測(cè)、高分子材料結(jié)構(gòu)等(常使用反射模式)。
